棉花纤维发生相关AFLP标记罗明、李名扬\侯磊\肖月华、张正圣、裴炎1S，季道藩2（1.西南农业大学生物技术中心，重庆400716；2.浙江大学，杭州310000）因系进行DNA多态性分析。在64对引物产生的6 360多条扩增带中，发现1条差异带（CFj稳定出现在有纤维和无纤维之间。进一步用徐州142无绒无絮突变系与纤维发育正常的渝棉一号的杂交后Rf2、f3分离群体以及几个陆地棉品种作材料验证，结果表明，差异带（5）与纤维的产生呈共分离，该差异带是与棉花纤维发生相关的分子标记。进而对0进行回收、克隆和序列测定，0长205bp，通过6个开放阅读框推断的氨基酸序列，与酚羟化酶t亚基、外表皮蛋白C、NADH脱氢酶亚基l、NADfrCoQ氧化还原酶、2-氧代-铁氧还蛋白-氧化还原酶棉花是世界上*重要的经济作物之一，是首要的纤维作物和重要的油料作物，各主要产棉国都十分重视棉花发育和遗传的研究。棉花纤维的发育以单细胞形式出现，形态变化大，其长/径比可达10003000.在棉花纤维发育过程中，纤维细胞具有均一性和同步性。因而，棉花是研究纤维发育与纤维素合成的理想材料。同时，由于棉花纤维发育相关基因的竞隆具有巨大的潜在经济价值，引起广泛的关注，一些与纤维发育相关基因甚至EST序列都申请了专利保护。因此，研究棉花纤维发育的分子机理具有重要的理论价值和实践意义。

　　利用突变体是研究基因及其功能的主要手段，徐州142无绒无絮（fuzzless-lintless，fl）是纤维发育正常的徐州142的天然突变体。除种子无毛外，fl突变体在表型上与野生型（wildtype，WT）没有区别，遗传分析表明fl突变体是产生于徐州142的一个隐性突变。

　　分子标记是基因鉴定、分离和克隆的途径之一。AFLP分子标记技术具有稳定、高效、覆盖面广、多态性检出率高的特点，因此我们利用该标记技术在徐州142无绒无絮（无纤维）突变体（fl）和徐州142野生型（WT）之间寻找与棉花纤维发生相关的AFLP标记。进而探讨棉花纤维发生的分子机理。

　　1材料和方法1.1材料的来源和培育徐州142无绒无絮突变系、徐州142野生型和T586由中国棉基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（批准号：39830240）；国家教委博士点基金（批准号：1999-006003）：罗明（1968），男，四川大竹人，硕士，助理研究员。研究方向：分子生物学花研究所提供。渝桷一号（9208007HI）和9202034由西南衣业大学培育，泗棉3号由江苏省泗阳棉花原种场提供。1997年在重庆合川西南农大教学为CF，2.2G分离群体的AFLP验证为了验证CF，特征片段与郴花纤维发生相关的可靠性。

　　在徐州142无绒无絮（无纤维）突变系与纤维发正常的渝棉一号的杂交后代1分麻群体56个单株中，选取有纤维的23个单株、无减维的2个单株编号分别为：M97-36、M97-53；由于田间损失，仅获得2株无绒无絮单株），共25个单株进行验证。结果表明（），有纤维的23株都有CB标记，无绒无絮的两个单株无CF，标记。由于有纤维的23株衣分分布在15%42%，说明CF3S记与纤维的多少无关，可能是与纤维有无相关的分子标记。

　　X3分离群体的AFLP验诬鉴于徐州142无绒无絮（无纤维）突变体与渝棉一号的分离群体中无绒无絮单株偏少，于是电F3继续进行跄证。F3中每个匕3家系种植5株，共获得246个有效单株，其中有纤维单株229株，无纤维单株丨7株。对分别来自21个Pi：3家系的21个有纤维单株和来自7个F2；3家系的丨7个无纤维单株进行AFLP分析，结果表明（），丨7个无纤维单株均无CF，标i己，而21个有纤维单株都具有GF，标记。说明6标记与有纤维呈共分离，是与棉纤维发生相关的分子标记。

　　2.4陆地棉品种品系间的AFLP验证选渝棉一号，9202034.泗棉3号、T586 4个正常陆地棉品种品系进行AFLP分析。结果表明（），以上品种都具有CF，标记，这些品种的衣分各不相同，但都是纤维发育正常的栽培品种品系说明CF，标记的确与棉纤维的发生相关》2.5CF；核酸序列和比较标记（CF，）的测序结果如下，除去两边的接头，片段总长205bp，核苷酸序列为中根据6种开放阅读框推测其蛋白质序列，发现与酚羟化酶亚基、外表皮蛋白脱氩酶亚基l、NADFhQ氧化还原酶、2-代-铁氧还蛋白-氧化还原酶以及假陆地品种（系）狯证的AFLP图销（引物对E~agg、Mcta）3兮4 4：T55：徐州W2无絮丨6；徐州142有*；蓄头所示为CF，标ig 3讨论AFLP既具有RFUP稳定可靠。重复性好的特点，同时也具有RAPD快速高效的特点，是迄今为止*为有效的分子标记技术之一。近年来由于棉花DNA提取技术的改进，…在棉花分子标记的研究中有较多的应用IHL特别是在近等基因系间DNA多态性分析上，覆盖面广、多态性检出率离的AFLP标记技术具有较大的优势。我们使用的徐州142无绒无絮突变系是徐州丨42有绒有絮野生型的天然突变体13气推测该突变是点单基因位点突变。要找到点突变体和野生型之间的差异具有很大的困难，于是我们采用了AFLP分子标记技术，实验证明利用AFLP标记技术能获得较好的结果。

　　张天真等遗传分析表明徐州142无绒无絮突变系是产生于徐州142的1个隐性突变气它和正常的有短绒、有纤维的陆地棉遗传标准系杂交的6群体有丨/16无短绒无纤维单株气在我们使用的徐州142无绒无絮与渝棉一号杂交的F体中，56个单株中发现2株（M97-36和M97-53）无线无絮，而理论上应该出现3株或4株，这可能是因为田间损失造成JF2群体数置偏小和部分单株丢失，从而使统计比例偏差太大。正是由于群体无纤维株偏少，才在F3而证明CF，标记与有纤维呈共分离。虽然F2的情况也可能影响F2的群体组成，但由于一般构建基因池所需的单株数量为10~15株。丨7株无纤维单株足以证明该标记的可靠性。

　　到B前为止研究者已筛选到许多与棉纤维品质和产量性状相关的分子标记这些研究主要着重于纤维发育后3个时期相关标记的寻找，并且许多是以海陆杂交构建作囝群体而获得叭与棉纾维发生有关的标记还未见报道，￥等叩（〗998）利用无纤维突变体SL-171和有纤维野生DH59-64从基因表达和生化角度进行研究1发现蔗糖薅基因的表达对纤维的形成有非常重要的作用，但无法确定这种表达是无纤维发生的起因或是结果，前人用徐州142无绒无絮突变体和显。隐性无短绒（光籽>基因系等位性M验的结果表明，徐州142突变体的无短绒基因是的等位基因，是％的非等位基因，证实它为一种新的无纤维突变体，若设/1*为棉钎维发生基因，剌徐州142无绒无絮的基因型为Wi*2/y/3，徐州142野生型的基因S为*v2Ayy；3ul，我们利用这种新的无纤维突变体获得分子标记与Ruan（i998）的研究结果是否有关和关系如何，还需要进一步研究。

　　于晓红等M对徐州〖42及其无纤维突变体进行RT-PCR分析表明：fl种子中梯、*加和Cc囔1M基因异常或极低水平表达与种子无毛有关，CFi分子标记目前与说、和基因的关系还不楚，这可能因为该DNA片段太短。

　　花纤维是棉花胚珠外珠被表皮层的单细胞分化发宵面成Ramsey和BernlJu发现开花前24小时，纤维原始细胞的细胞核、细胞质和液泡出现较明显的变化，表皮细胞产生大量小液泡，其中充满电子密集的酚类物质。开花前16小时，胚珠表皮层出现亮、暗两类细胞。暗细胞由于液泡内酚类物质进入细胞质内，破坏了细胞质内的IAA氧化酶，相应提篼了IAA的活性，从而促进纤维发生和伸长；相应地，如果酚类物质不能形成或形成太少，则可能抑制纤维发生。近年来，人工培养未受精胚珠在IAA和G'作用下也能诱导出纤维ua.刘康等e3认为开花当天内源IAA含量的急剧上升可能是胚珠表皮细胞迅速伸长的一个重要原因，从而认为酚类物质的增加与棉纤维发生有密切关系。CF，标记对应的氨基酸序列之一与酚羟化酶亚基有较高的同源性（High score：44），酚羟化酶在酚类物质的形成中具有重要作用，徐州142无纤维突变体是否是由于酚羟化酶的作用丧失或减小而形成，还有待深人研究。